颜色是生物体重要的表型特征，并且与伪装、免疫、体温调节等生物学功能相关。软体动物具有丰富的贝壳颜色，这些贝壳颜色大致可分为色素色和结构色两大类。壳色主要由外套膜产生的色素决定，而构成贝壳的碳酸钙晶体的微观结构、贝类的饮食也可能影响贝壳着色。贝壳中的色素和与色素相关的蛋白质均可能影响贝壳着色及色素在贝壳内部和外部的分布。

贝类是世界第二大动物门类，壳色和壳纹是贝类最重要的表型特征之一。贝类的壳色是一个对生产、育种有重要意义的可遗传性状，其不仅是重要的生态形状和行为有关，还与生长、存活等表型性状有关。因此，壳色可作为经济性状进行选育进而得到新的贝类品种。为更好地开展壳色育种，了解贝壳颜色的进化和生态意义，鲁东大学农学院王晓通教授带领海洋生物资源开发与利用团队致力科研攻关，深入解析了长牡蛎外套膜外褶皱调控长牡蛎壳色形成的作用机制。该研究有助于了解贝类色素沉着的机制，对更好地开展壳色育种具有重要意义。

作为我国重要的经济养殖贝类，长牡蛎在中国沿海分布广泛，因其经济、生物学和生态学的重要性而被广泛研究。多种壳色（白色、金色、黑色）的长牡蛎品种已经被选育出来，以提高牡蛎养殖的商业价值。王晓通表示：“迄今为止，有证据表明存在控制壳外套膜边缘色素沉着的基因，基于遗传图谱也定位到一些壳色性状相关的QTL，通过lncRNA分析、RNAi等手段也找到一些与长牡蛎壳色相关的基因，然而长牡蛎贝壳色素沉着的机制具体如何尚不清楚。此外，长牡蛎的贝壳外表面颜色除了白色、金色、黑色等纯色，长牡蛎还具有放射状的条纹图案，条纹状的色素沉着被认为是一种多基因控制的数量性状。在自然界中，有的鱼类和哺乳动物体表存在条纹图案，其形成的分子机制各有不同，条纹的形成作为一个有趣的生物学问题被广泛而深刻的研究，而贝壳中条纹的形成机制却鲜有研究。”

由于很多基因功能验证的技术在贝类中尚不能应用，并且牡蛎基因组的杂合度很高，因此筛选出可靠的性状相关基因对于贝类学研究尤为重要。在此背景下，为最大程度消除个体遗传背景差异带来的干扰，更加准确地筛查出壳色相关基因，王晓通团队在研究中选择壳表面同时具有黑、白条纹的牡蛎，对同一个体的黑、白外套膜进行配对比较找到最初的线索，并结合形态观察与转录组分析、外套膜三褶皱的切割实验、黑/白壳长牡蛎的切壳实验及壳膜的扫描电镜（SEM）观察、壳膜几丁质的提取及傅里叶变换红外光谱 (FTIR）鉴定、LC-MS/MS分析及透射电镜（TEM）观察、序列分析及系统发生分析、RNA提取、cDNA合成及荧光定量PCR、原位杂交、CgCBP 蛋白的几丁质结合及碳酸钙沉积功能验证，通过RNA干扰实验在牡蛎体内验证 CgCBP 功能的方法，对黑壳、白壳及条纹壳牡蛎的外套膜、壳膜进行分析，进一步解析长牡蛎贝壳色素沉着机制。

本研究首次将长牡蛎壳色形成的亚器官定位在外套膜的外褶皱。在研究过程中，王晓通团队发现，根据对300只黑壳和白壳长牡蛎的观测统计，外壳颜色和外套膜边缘颜色的相关性并不适用于所有外套膜边缘结构。这种壳色对应关系只存在于外褶皱中，而外套膜中、内褶皱颜色与外壳颜色并不相关；通过条纹壳牡蛎外套膜三褶皱的切割实验表明，仅外褶皱在壳膜的形成中发挥关键作用；利用切壳实验发现新生的黑壳膜和白壳膜在色素沉着上有着显著差异，黑、白壳膜在扫描电镜结构上也存在明显差异，黑壳膜的片层结构更大，且片层边缘存在大量孔隙结构，而白壳膜片层结构较小，片层电镜结构更碎片化；此外，通过外套膜三褶皱的转录组分析、透射电镜观察以及壳膜的蛋白质组分析，发现外褶皱与壳膜均与黑色素生物合成、几丁质结合有关，并且壳膜结构与色素沉着具有功能相关性；此研究还发现一个在黑色外褶皱超高表达（高于其他组织800倍）的未知功能基因LOC105336951，通过几丁质磁珠结合、蛋白免疫印迹方法，确定该基因编码蛋白能与几丁质特异性结合，因此将其命名为长牡蛎几丁质结合蛋白（CgCBP）基因，通过原位杂交进一步确定其仅在外套膜外侧上皮表达。该基因敲降会引起壳膜结构改变，并进一步影响壳膜色素沉着。此研究的另外一个亮点是选择同一只条纹壳牡蛎的位置相邻的黑色与白色外套膜进行配对比较分析，最大程度上消除不同个体遗传背景差异带来的干扰。